目前高通量測(cè)序技術(shù)在臨床檢測(cè)上的應(yīng)用越來越廣泛，今天給大家簡(jiǎn)單介紹一下NGS實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和合理分區(qū)。

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什么是高通量測(cè)序（NGS）技術(shù)？

高通量測(cè)序技術(shù)又稱NGS (Next Generation Sequencing) 技術(shù)，它是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序技術(shù)（即一代測(cè)序技術(shù)）進(jìn)行了革命性的升級(jí)，可同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診療實(shí)踐中，預(yù)示著疾病診療分子時(shí)代的到來。

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什么是高通量測(cè)序（NGS）實(shí)驗(yàn)室？

高通量測(cè)序檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室也叫NGS實(shí)驗(yàn)室，是以高通量測(cè)序技術(shù)為檢測(cè)手段，來完成臨床疾病篩查、診斷或輔助診斷、腫瘤基因突變檢測(cè)等項(xiàng)目。高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)包括濕桌實(shí)驗(yàn)過程和干桌實(shí)驗(yàn)過程，其中濕桌實(shí)驗(yàn)是指實(shí)驗(yàn)標(biāo)本預(yù)處理、核酸提取及其片段化、建庫(kù)、擴(kuò)增、靶序列富集、混樣、測(cè)序前準(zhǔn)備及測(cè)序，干桌實(shí)驗(yàn)是指測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析、對(duì)比、注釋和結(jié)果報(bào)告等生物信息學(xué)分析流程。

由于NGS技術(shù)對(duì)所檢測(cè)的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；且NGS實(shí)驗(yàn)要求高、影響因素多，實(shí)驗(yàn)過程處理不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果異常。因此一個(gè)嚴(yán)格有序、規(guī)范的NGS實(shí)驗(yàn)室是非常必要的。

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NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則有哪些？

1 各區(qū)獨(dú)立

實(shí)驗(yàn)室各個(gè)區(qū)域無論是在物理空間上還是實(shí)際使用過程中，都應(yīng)當(dāng)處于完全分隔狀態(tài)，并且各區(qū)域之間不能有空氣的直接流通。

2 單一流向

NGS檢測(cè)通常涉及PCR擴(kuò)增及核酸純化富集等過程，任何樣本源性污染、分析標(biāo)簽源性污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染或氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，因此各實(shí)驗(yàn)區(qū)域與緩沖間應(yīng)有一定的通風(fēng)壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染。

3 因地制宜

新建實(shí)驗(yàn)室除合理規(guī)范外，也要易于管理；若原有實(shí)驗(yàn)室通過合理的規(guī)劃改造也能滿足質(zhì)量管理要求，亦可不必特地新建實(shí)驗(yàn)室。

4 方便工作

實(shí)驗(yàn)室區(qū)域選擇及空間設(shè)計(jì)還應(yīng)最大限度考慮是否方便日常監(jiān)測(cè)工作，包括方便人員流動(dòng)效率、大型儀器設(shè)備進(jìn)出落地等。

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NGS實(shí)驗(yàn)室如何分區(qū)？

圖1 NGS實(shí)驗(yàn)室分區(qū)示意圖（引自李金明. 高通量測(cè)序技術(shù)）

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試劑準(zhǔn)備區(qū)

本區(qū)域?yàn)闈崈魠^(qū)域，用于試劑的配制、分裝及少量?jī)?chǔ)藏等，需存放于此區(qū)域的試劑不可逆行由后續(xù)處理樣本的區(qū)域進(jìn)入。另外，試劑盒中的陽(yáng)性質(zhì)控品和對(duì)照品不應(yīng)貯存于此區(qū)域。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、純水儀、渦旋振蕩器、移液器和離心機(jī)。

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樣本準(zhǔn)備區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，用于核酸的提取及濃度測(cè)定。在提取不同類型的樣本（新鮮組織、FFPE、血液等）核酸時(shí)應(yīng)避免樣本之間的交叉污染，建議在區(qū)域內(nèi)設(shè)置不同樣本的獨(dú)立的超凈工作臺(tái)。布局時(shí)應(yīng)注意高速離心機(jī)運(yùn)行時(shí)產(chǎn)生的振動(dòng)是否干擾其它設(shè)備等細(xì)節(jié)。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、核酸自動(dòng)提取儀、高速離心機(jī)、水浴鍋、恒溫金屬浴、核酸定量?jī)x、冰箱、移液器、渦旋振蕩器和磁力架。

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文庫(kù)制備區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，用于文庫(kù)的構(gòu)建。NGS檢測(cè)時(shí)常見的文庫(kù)制備方法有雜交捕獲法和擴(kuò)增子法，兩種方法均包含通過PCR放大文庫(kù)產(chǎn)量的步驟，因此在文庫(kù)制備區(qū)構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，建議文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物傳遞至下一階段區(qū)域（雜交捕獲區(qū)）進(jìn)行純化及后續(xù)操作。另外，組織樣本進(jìn)行捕獲法建庫(kù)時(shí)需要先對(duì)樣本做片段化處理，因此操作臺(tái)面規(guī)劃時(shí)應(yīng)區(qū)分片段化區(qū)域和建庫(kù)區(qū)域。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、普通PCR儀、核酸定量?jī)x、磁力架、超聲打斷儀、移液器、渦旋振蕩器和離心機(jī)。

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雜交捕獲區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，用于文庫(kù)擴(kuò)增后的純化，以及后續(xù)的二次擴(kuò)增或捕獲富集等步驟。嚴(yán)防此區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物及氣溶膠等對(duì)其它區(qū)域的污染，盡量減少人員在該區(qū)域與其它區(qū)域之間反復(fù)頻繁流動(dòng)，同時(shí)該區(qū)域的實(shí)驗(yàn)物品、實(shí)驗(yàn)服等盡量避免外帶。

儀器設(shè)備：普通PCR儀、核酸定量?jī)x、磁力架、金屬浴、真空濃縮儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機(jī)。

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文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，對(duì)雜交捕獲產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集，同時(shí)對(duì)上機(jī)測(cè)序前的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)控，并且完成文庫(kù)上機(jī)前文庫(kù)最終的稀釋和混樣。

儀器設(shè)備：冰箱、普通PCR儀、核酸定量?jī)x、磁力架、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機(jī)。

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測(cè)序分析區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，用于文庫(kù)的上機(jī)測(cè)序。此區(qū)域應(yīng)配備穩(wěn)定的供電設(shè)施及備用電源，并配備獨(dú)立的制冷設(shè)施保證測(cè)序儀在相對(duì)恒定的溫濕度環(huán)境下工作；還需開設(shè)適宜面積的機(jī)房用于放置服務(wù)器等，所配備的網(wǎng)關(guān)設(shè)備應(yīng)兼具穩(wěn)定性和安全性，確保數(shù)據(jù)有效、安全傳輸。

儀器設(shè)備：測(cè)序儀、服務(wù)器、穩(wěn)定電源。

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電泳區(qū)

本區(qū)域?yàn)榘胛廴緟^(qū)，用于核酸樣本質(zhì)量和文庫(kù)片段的分析。

儀器設(shè)備：冰箱、凝膠電泳、生物片段分析儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機(jī)。

總之，一個(gè)規(guī)范的NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室是獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果的重要保障，在實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行過程中要始終堅(jiān)持“工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)”的基本準(zhǔn)則。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李金明. 高通量測(cè)序技術(shù)[M]. 第1版. 北京: 科學(xué)出版社,2018.